При внутриклеточной репродукции вирусов формиру­ется структуры, отсутствующие в незараженных вирусом клетках. Эти образования — места синтеза и сборки "3?бвирусных структур (компонентов дочерних вирионов) ЙОлучили разные наименования — клеточные матриксы, "«фабрики», виропласты, включения. Эти структуры явля-рггся продуктами кооперативных процессов клетки и арруса, где главенствующая роль принадлежит клетке. ч; Морфологически матриксы выглядят по-разному ^разных вирусов. Обычно это места синтеза белков, ^$ поэтому в матриксах обнаруживаются значительные Ц&опления рибосом (полисомы). В их состав входят Цвкже разные клеточные структуры — мембраны, микро-^рубочки, осмиофильные волокна и т. п. (рис. 8). При

 

М матриксы проделывают определенный цикл развития, ш вначале в них превалируют полисомы, то позже Щвявляются субвирусные компоненты, которые можно

 

 

а — «фабрики» реовируса в культуре клеток почек обезьян; б — «фабрики» орбивируса в глиальной клетке головного моз­га мышей-сосунков; в — очаг иммунофлюоресценции в куль­туре клеток почек человека, за­раженной вирусом Сендай.

выявить при использова­нии серологических ме­тодов исследования типа ИФ (рис. 8, в) или ИЭМ, а нередко и при обычной ЭМ. При ряде инфекций матриксы связаны с мембранами эндоплаз-матической сети, аппа­ратом Гольджи и други­ми клеточными структу­рами, куда транспорти­руются все вирусные компоненты.

Образования, сход­ные с цитоплазматичес-кими матриксами, обна­ружены также в ядрах,где происходит репро­дукция большинстваДНК-содержащих виру­сов. При окрашиванииклеток они имеют видвнутриядерных включе­ний. На поздних стади­ях инфекции в мйтрик-сах или по соседству сними накапливаетсябольшое число вирио-нов, часто образующихкристаллоподобныеформирования. Внут­риядерные кристал-лоподобные включения

9. Скопление нуклеокапсидов 8У5 в цитоплазме (электронно-скопическое изображение).

 

обнаружены, например, у реовирусов, аденовирусов, папо-вавирусов, парвовирусов. Процесс формирования вирионов у вирусов, имеющих липопротеидные оболочки, значительно более сложен, чем у просто устроенных вирусов, и про­текает многоступенчато. Так, например, изометрические нуклеокапсиды вируса герпеса формируются в ядрах и в дальнейшем транспортируются в цитоплазму путем почко­вания через ядерную мембрану. После этого вирионы транспортируются к аппарату Гольджи, проходя через мем­брану эндоплазматической сети и захватывая ее, как это было при прохождении через ядерную мембрану. Поэтому внеклеточный вирус имеет две оболочки, одна из которых формируется из ядерной, вторая — из цитоплазматической мембраны (см. рис. 7, е).

Формирование РНП вирионов парамиксовирусов про­исходит в цитоплазме, где они накапливаются в виде тяжей (рис 9) и затем транспортируются к плазмати­ческой мембране. В это время плазматическая мембрана клетки уже модифицирована, так как в нее встроены с наружной стороны вирусные гликопротеиды, а с внут­ренней стороны — матриксный белок. При приближении к таким модифицированным участкам плазматической мембраны рибонуклеопротеидные тяжи свертываются в плотно упакованные клубки и, проходя через плазмати­ческую мембрану, покрываются ею, приобретая таким путем внешнюю оболочку (рис. 10, а). Этот тип форми­рования вирионов называется почкованием. Почкование может происходить и во внутриклеточные вакуоли (рис. 10, б).

Морфогенез вируса оспы еще более сложен. В цито­плазме образуются сложные матриксы, в которых про­исходит синтез многочисленных вирусспецифических структур. Здесь же происходит и формирование вирионов, которые вначале представляют пузырчатые образования (рис. 11), и лишь позже из этих предшественников формируются зрелые вирионы. Выход вирусных частиц из клетки осуществляется либо путем почкования через мембраны во внутриклеточные вакуоли, либо при разру­шении клетки.

Быстрый прогресс в области вирусологических знаний, основанный в значительной мере на достижениях смеж­ных естественных наук, обусловил возможность углублен­ного познания природы вирусов. Как ни в одной другой науке, в вирусологии прослеживается быстрая и четкая смена уровней познания — от уровня организма до суб­молекулярного.

Приведенные периоды развития вирусологии отражают те уровни, которые являлись доминирующими в течение одного — двух десятилетий.

Уровень организма (30-40-е годы XX века). Основ­ной экспериментальной моделью являются лабораторные

животные (белые мыши, крысы, кролики, хомяки и т. д.), основным модельным вирусом — вирус гриппа.

В 40-е годы в вирусологию в качестве эксперименталь­ной модели прочно входят куриные эмбрионы в связи с их высокой чувствительностью к вирусам гриппа, оспы и некоторым другим. Использование этой модели стало возможным благодаря исследованиям австралийского ви­русолога и иммунолога Ф. М. Бернета, автора пособия по вирусологии «Вирус как организм».

Открытие в . американским вирусологом Херс-том феномена гемагглютинации немало способствовало изучению взаимодействия вируса с клеткой на модели вируса гриппа и эритроцитов.

Большим вкладом отечественных вирусологов в меди­цинскую вирусологию явилось изучение природна-очаго-вых заболеваний — эпидемических энцефалитов. В . была организована первая экспедиция, возглавляемая Л. А. Зильбером, в составе которой были Б. Н. Левкович, А. К. Шубладзе, М. П. Чумаков, В. Д. Соловьев и др. Благодаря проведенным исследованиям был открыт вирус клещевого энцефалита, выявлены его переносчики — ик-содовые клещи, разработаны методы лабораторной диаг­ностики, профилактики и лечения. Советскими вирусоло­гами были изучены вирусные геморрагические лихорадки, разработаны препараты для диагностических и лечебно-профилактических целей.

Уровень клетки (50-е годы). В . происходит значительное событие в истории вирусологии — открытие возможности культивировать клетки в искусственных условиях. В . Дж. Эндерс, Т. Уэллер, Ф. Роббинс получили Нобелевскую премию за разработку метода куль­туры клеток. Использование культуры клеток в вирусоло­гии явилось подлинно революционным событием, послу­жившим основой для выделения многочисленных новых вирусов, их идентификации, клонирования, изучения их взаимодействия с клеткой. Появилась возможность полу­чения культуральных вакцин. Эта возможность была до­казана на примере вакцины против полиомиелита. В со­дружестве с американскими вирусологами Дж. Солком и А. Сейбином, советскими вирусологами М. П. Чумаковым, А. А. Смородинцевым и др. была разработана технология производства, апробирована и внедрена в практику убитая и живая вакцины против полиомиелита. В . была проведена массовая иммунизация детского населения в СССР  (около 15 млн.)  живой полиомиелитной вакциной,

7

в результате резко снизилась заболеваемость полиомиели том и практически исчезли паралитические формы заболе­вания. В . за разработку и внедрение в практику живой полиомиелитной вакцины М. П. Чумакову и А. А. Смородинцеву была присуждена Ленинская премия. Другим важным приложением техники выращивания виру­сов явилось получение Дж. Эндерсом и А. А. Смородинце-вым живой коревой вакцины, широкое применение кото­рой обусловило значительное снижение заболеваемости корью и является основой для искоренения этой инфек­ции.

Широко внедрялись в практику и другие культураль-ные вакцины — энцефалитная, ящурная, антирабическая и т. д.

Молекулярный уровень (60-е годы). В вирусологии широко стали использовать методы молекулярной биоло­гии, а вирусы благодаря простой организации их генома стали распространенной моделью для молекулярной био­логии. Ни одно открытие молекулярной биологии не об­ходится без вирусной модели, включая генетический код, весь механизм внутриклеточной экспрессии генома, реп­ликацию ДНК, процессинг (созревание) информационных РНК и т. д. В свою очередь использование молекуляр­ных методов в вирусологии позволило установить прин­ципы строения (архитектуры) вирусных индивидуумов — вирионов (термин, введенный французским микробиоло­гом А. Львовом), способы проникновения вирусов в клетку и их репродукции.

Субмолекулярный уровень (70-е годы). Стремительное развитие молекулярной биологии открывает возможности изучения первичной структуры нуклеиновых кислот и бел­ков. Появляются методы секвенирования ДНК, определе­ния аминокислотных последовательностей белка. Полу­чают первые генетические карты геномов ДНК-содержа-щих вирусов.

В . Д. Балтимором и одновременно Г. Теминым и С. Мизутани была открыта обратная транскриптаза в составе РНК-содержащих онкогенных вирусов, фермент, переписывающий РНК на ДНК. Становится реальным синтез гена с помощью этого фермента на матрице, вы­деленной из полисом иРНК. Появляется возможность переписать РНК в ДНК и провести ее секвенирование.

В . возникает новый раздел молекулярной био­логии — генная инженерия. В этом году публикуется со­общение  П.  Берга в  США  о  создании  рекомбинантной

молекулы ДНК, которое положило начало эре генной инженерии. Появляется возможность получения большого количества нуклеиновых кислот и белков путем введения рекомбинантных ДНК в состав генома прокариот и прос­тых эукариот. Одним из основных практических прило­жений нового метода является получение дешевых препа­ратов белков, имеющих значение в медицине (инсулин, интерферон) и сельском хозяйстве (дешевые белковые корма для скота).

Этот период характеризуется важными открытиями в области медицинской вирусологии. В фокусе изучения — три наиболее массовых болезни, наносящих огромный ущерб здоровью людей и народному хозяйству,— грипп, рак, гепатит.

Установлены причины регулярно повторяющихся пан­демий гриппа. Детально изучены вирусы рака животных (птиц, грызунов), установлена структура их генома и идентифицирован ген, ответственный за злокачественную трансформацию клеток — онкоген. Установлено, что при­чиной гепатитов А и В являются разные вирусы: гепатит А вызывает РНК-содержащий вирус, отнесенный к се­мейству пикорнавирусов, а гепатит В — ДНК-содержащий вирус, отнесенный к семейству гепаднавирусов. В . Г. Бламберг, исследуя антигены крови у аборигенов Австралии, обнаружил так называемый австралийский ан­тиген, который он принял за один из антигенов крови. Позже было выявлено, что этот антиген является анти­геном гепатита В, носительство которого распространено во всех странах мира. За открытие австралийского анти­гена Г. Бламбергу в . была присуждена Нобелевская премия.

Другая Нобелевская премия в . присуждена аме­риканскому ученому К. Гаидушеку, который установил вирусную этиологию, одной из медленных инфекций че­ловека — куру, наблюдающейся в одном из туземных пле­мен на острове Новая Гвинея и связанной с ритуальным обрядом — поеданием зараженного мозга умерших род­ственников. Благодаря усилиям К. Гайдушека, поселивше­гося на острове Новая Гвинея, эта традиция была иско­ренена и число больных резко сократилось.

 

Современная классификация вирусов является уни­версальной для вирусов позвоночных, беспозвоночных, растений и простейших. Она основана на фундаменталь­ных свойствах вирионов, из которых ведущими являются признаки, характеризующие нуклеиновую кислоту,  мор-

фологию, стратегию генома и антигенные свойства. Фунда­ментальные свойства поставлены на первое место, по­скольку вирусы со сходными антигенными свойствами обладают и сходным типом нуклеиновой кислоты, сход­ными морфологическими и биофизическими свойствами.

Важным признаком для классификации, который учи­тывается наряду со структурными признаками, является стратегия вирусного генома, под которой понимают ис­пользуемый вирусом способ репродукции, обусловленный особенностями его генетического материала. Например, полярность вирусной РНК является основным критерием для группировки вирусов и при отсутствии общих анти­генных свойств.

Антигенные и другие биологические свойства являются признаками, лежащими в основе формирования вида и имеющими значение в пределах рода.

В основу современной классификации положены сле­дующие основные критерии.

1.         Тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), ее структура (количество нитей).

2.    Наличие липопротеидной оболочки.

3.         Стратегия вирусного генома.

4.    Размер и морфология вириона, тип симметрии, число капсомеров.

5.         Феномены генетических, взаимодействий.

6.         Круг восприимчивых хозяев.

7.         Патогенность, в том числе патологические измене­ния в клетках и образование внутриклеточных включений.

8.         Географическое распространение.

9.         Способ передачи.

10. Антигенные свойства.

На основании перечисленных признаков вирусы делят­ся на семейства, подсемейства, роды и типы. Деление на семейства произведено по критериям, изложенным в пунктах 1 и 2, деление на роды и типы — на основании нижеперечисленных признаков. Схематически строение семейств вирионов, поражающих позвоночных, приведено на рис. 12. Дополнительно выделены еще 2 семейства: Серадпаушдае и ИауМгМае (выделенные из семейства То§ау1Пс1ае). Семейства вирусов животных и их таксоно­мические признаки приведены в табл. 7 и 8.

Современная классификация вирусов человека и жи­вотных охватывает более 4/5 всех известных вирусов, которые распределены в 19 семейств, из них 7 — ДНК-содержащих и 12— РНК-содержащих вирусов.

В зараженной клетке вирусный геном кодирует синтез двух групп белков: 1) структурных, которые входят в со­став вирусных частиц потомства, и 2) неструктурных, которые обслуживают процесс внутриклеточной репродук­ции вируса на разных его этапах, но в состав вирусных частиц не входят.

Структурные белки. Количество структурных белков в составе вирусной частицы варьирует в широких пределах в зависимости от сложности организации вириона. Наибо­лее просто организованный вирус табачной мозаики со­держит всего один небольшой белок с молекулярной массой 17—18- 10³, некоторые фаги содержат 2—3 белка, просто организованные вирусы животных — 3—4 белка. Сложно устроенные вирусы, такие как вирусы оспы, содержат более 30 структурных белков.

Структурные белки делятся на 2 группы:

1)         капсидные белки, образующие капсид, т. е. футляр для нуклеиновой кислоты вируса (от лат. сарза — вме­стилище), и входящие в состав капсида геномные белки, и ферменты;

2)    суперкапсидные белки, входящие в состав суперкап-сида, т. е. наружной вирусной оболочки.

Поскольку суперкапсид называют также «пеплос» (от греч. рер1оз — покров, мантия), эти белки называют пепло-мерами.

Просто организованные вирусы, представляющие собой нуклеокапсид, содержат только капсидные белки. Сложно организованные вирусы содержат капсидные и суперкап-слдные белки.

Капсидные белки. Первоначальное представление о том, что капсидные белки являются всего лишь инерт­ной оболочкой для вирусной нуклеиновой кислоты, сложи­лось на основании изучения наиболее просто организо­ванного вируса табачной мозаики, частица которого со­стоит из одной молекулы РНК и одного типа белка, образующего чехол для РНК. Однако такое представление неправильно. Хотя основной функцией капсидных белков

является функция защиты вирусного генома от неблаго­приятных воздействий внешней среды, у многих вирусов в составе капсида есть белки и с другими функциями. Поэтому термин «капсид» далеко выходит за пределы представления о нем как о футляре или чехле для вирус­ной нуклеиновой кислоты.

В составе капсида некоторых вирусов (пикорнавирусы, паповавирусы, аденовирусы) содержатся белки, ковалент-но связанные с вирусным геномом (геномные белки). Эти белки являются терминальными, т. е. соединенными с концом вирусной нуклеиновой кислоты. Функции их неразрывно связаны с функциями генома и их регуля­цией.

У ряда сложно организованных вирусов в составе кап­сида имеются ферменты, осуществляющие транскрипцию и репликацию вирусного генома — РНК и ДНК (РНК-и ДНК-полимеразы), а также ферменты, модифицирую­щие концы иРНК. Если ферменты и геномные белки представлены единичными молекулами, то капсидные бел­ки представлены множественными молекулами. Эти белки и формируют капсидную оболочку, в которую у сложно организованных вирусов вставлены молекулы белков с дру­гими функциями.

Основным принципом строения капсидной оболочки вирусов является принцип субьединичности, т. е. построе­ние капсидной оболочки из субъединиц-капсомеров, обра­зованных идентичными полипептидными цепями. Пра­вильно построенные белковые субъединицы — капсомеры возникают благодаря способности вирусных капсидных белков к самосборке. Самосборка объясняется тем, что упорядоченная структура — капсид имеет наименьшую свободную энергию по сравнению с неупорядоченными белковыми молекулами. Сборка капсидной оболочки из субъединиц запрограммирована в первичной структуре белка и происходит самопроизвольно или при взаимо­действии с нуклеиновой кислотой.

Принцип субъединичности в строении вирусного капси­да является универсальным свойством капсидных белков и имеет огромное значение для вирусов. Благодаря этому свойству достигается огромная экономия генетического материала. Если бы капсидная оболочка была построена из разных белков, то на кодирование ее потребовалась бы основная часть генетической информации, заложенной в вирусном геноме. В действительности на кодирование, например,   одной   полипептидной   цепи   вируса   табачной

мозаики, расходуется менее 10% генома. Далее, в меха­низме самосборки заложена возможность контроля за полноценностью вирусных полипептидов: дефектные и чу­жеродные полипептидные цепи при таком способе сборки вирионов будут автоматически отбрасываться.

Описанная способность к самосборке в пробирке и в зараженной клетке характерна только для простых виру­сов. Сборка сложно организованных вирусов является го­раздо более сложным многоступенчатым процессом, хотя отдельные ее этапы, например формирование капсидов и нуклеокапсидов, также основаны на самосборке.

Суперкапсидные белки. Гликопротеиды. Суперкапсидные белки, или пепломеры, располагаются в липопротеидной оболочке (суперкапсиде или пеплосе) сложно устроенных вирусов. Они либо пронизывают насквозь липидный бислой как, например, гликопротеиды альфа-вирусов (вируса леса Семлики), либо не доходят до внутренней поверхности. Эти белки являются типичны­ми внутримембранными белками и имеют много общего с клеточными мембранными белками. Как и последние, суперкапсидные белки обычно гликозилированы. Углевод­ные цепочки прикреплены к молекуле полипептида в опре­деленных участках. Гликозилирование осуществляют кле­точные ферменты, поэтому один и тот же вирус, проду­цируемый разными видами клеток, может иметь разные у углеводные остатки: может варьировать как состав угле­водов, так и длина углеводной цепочки и место прикреп­ления ее к полипептидному остову.

У большинства вирусов гликопротеиды формируют «шипы» на поверхности вирусной частицы, длина которых достигает 7—10 им. Шипы представляют собой морфоло­гические субъединицы, построенные из нескольких моле­кул одного и того же белка. Вирусы гриппа имеют два типа шипов, построенных соответственно из гемагглютини-на и нейраминидазы. Парамиксовирусы также имеют два типа шипов, построенных соответственно из двух глико-протеидов (НИ и Р), рабдовирусы имеют только один гликопротеид и, соответственно, один тип шипов, а альфа-вирусы имеют два или три гликопротеида, формирующих один тип шипов.

Гликопротеиды являются амфипатическими молекула­ми: они состоят из наружной, гидрофильной части, кото­рая содержит на конце аминогруппу ДО -конец), и погру­женной в липидный бислой, гидрофобной части, которая содержит на погруженном конце гидроксильную группу

(С-конец). С-концом полипетид «заякоривается» в липид ном бислое. Есть, однако, и исключения из этого общего положения: нейраминидаза вируса гриппа взаимодействует с липидным бислоем не С-, а г4-концом.

Основной функцией гликопротеидов является взаимо­действие со специфическими рецепторами клеточной поверхности. Благодаря этим белкам осуществляется рас­познавание специфических клеточных рецепторов и прик­репление к ним вирусной частицы, т. е. адсорбция вируса на клетке. Поэтому гликопротеиды, выполняющие эту функцию, называют вирусными прикрепительными белка­ми.

Другой функцией гликопротеидов является участие в слиянии вирусной и клеточной мембран, т. е. в событии, ведущем к проникновению вирусных частиц в клетку. Ви­русные белки слияния ответственны за такие процессы, как гемолиз и слияние плазматических мембран соседних кле­ток, приводящие к образованию гигантских клеток, синци-тиев и симпластов.

«Адресная   функция»   вирусных   белков. Вирусы вызывают инфекционный процесс у относительно небольшого круга хозяев. Вирус должен «узнать» чувст­вительную клетку, которая сможет обеспечить продукцию полноценного вирусного потомства. Если бы вирус прони­кал в любую клетку, которая встретилась на его пути, это привело бы к исчезновению вирусов в результате деструк­ции "«родительской» вирусной частицы и отсутствия вирус­ного потомства. В процессе эволюции у вирусов выраба­тывалась так называемая адресная функция, т. е. поиск чувствительного хозяина среди бесконечного числа нечув­ствительных клеток. Эта функция реализуется путем на­личия специальных белков на поверхности вирусной ча­стицы,  которые узнают специфический рецептор на по­верхности чувствительной клетки.

Неструктурные белки. Неструктурные белки изучены гораздо хуже, чем структурные, поскольку их выделяют не из очищенных препаратов вирусов, а из зараженных клеток, и возникают трудности в их идентификации и очи­стке от клеточных белков.

К неструктурным белкам относятся:

1)           предшественники вирусных белков, которые отлича­ются от других неструктурных белков нестабильностью в зараженной клетке в результате быстрого нарезания на структурные белки;

2)     ферменты синтеза РНК и ДНК (РНК- и ДНК-26

полимеразы), обеспечивающие транскрипцию и реплика­цию вирусного генома;

3)           белки-регуляторы;

4)     ферменты,  модифицирующие вирусные  белки,  на­пример протеиназы и протеинкиназы.

Однако многие неструктурные белки при ряде вирус­ных   инфекций   еще   не   идентифицированы   и   функции их не  определены.  Типы  структурных  и  неструктурных белков просто и сложно устроенных вирусов и их функ-' ции показаны на схеме

Транскрипция — это переписывание ДНК на РНК по законам генетического кода. Это означает, что РНК сос­тоит из нуклеотидных последовательностей, комплемен­тарных ДНК. Нити ДНК в участке транскрипции разде­ляются и функционируют как матрицы, к которым при­соединяются комплементарные нуклеотиды благодаря спариванию комплементарных оснований (аденин связы­вается с тимином, урацил — с аденином, гуанин — с цито-зином и цитозин — с гуанином) (рис. 16). Транскрипция осуществляется с помощью специального фермента — РНК-полимеразы, который связывает нуклеотиды путем образования 3'-5'-фосфодиэфирных мостиков. Такое связывание происходит лишь в присутствии ДНК-матри­цы.

Продуктами транскрипции в клетке являются иРНК. Сама клеточная ДНК, являющаяся носителем генети­ческой информации, не может непосредственно програм­мировать синтез белка. Передачу генетической информа­ции от ДНК к рибосомам осуществляет РНК-посредник. На этом основана центральная догма молекулярной биологии, которая выражается следующей формулой:

транскрипция            трансляцияДНК —----- -------- * РНК —----------- ►белок,

где стрелки показывают направление переноса генети­ческой информации.

Реализация генетической информации у вирусов. Стра­тегия вирусного генома в отношении синтеза иРНК у разных вирусов различна. У ДНК-содержащих вирусов иРНК синтезируется на матрице одной из нитей ДНК. Формула переноса генетической информации у них такая же, как и в клетке.

транскрипция            трансляцияДНК—------ -------- >- РНК —----------- >• белок.

ДНК-содержащие вирусы, репродукция которых происхо­дит в ядре, используют для транскрипции клеточную полимеразу. К этим вирусам относятся паповавирусы, аденовирусы, вирусы герпеса. ДНК-содержащие вирусы

По вопросу о происхождении вирусов высказывались разные предположения. Одни авторы считали, что вирусы являются результатом крайнего проявления регрессивной эволюции бактерий или других одноклеточных организ­мов. Гипотеза регрессивной эволюции не может объяснить разнообразия генетического материала у вирусов, некле­точной их организации, дисъюнктивного способа репро­дукции и отсутствия белок-синтезирующих систем. Поэ­тому в настоящее время эта гипотеза имеет скорее исто­рическое    значение    и    не    разделяется    большинством вирусологов.

Согласно второй гипотезе вирусы являются потомками древних, доклеточных форм жизни — протобионтов, пред­шествовавших появлению клеточных форм жизни, с ко­торых и началась биологическая эволюция. Эта гипотеза также не разделяется в настоящее время большинством вирусологов, так как она не объясняет тех же вопро­сов,   разрешить   которые   оказалась   бессильной   первая гипотеза.

Третья гипотеза предполагает, что вирусы произошли от генетических элементов клеток, ставших автономными, хотя не ясно, какие из этих элементов дали начало столь большому разнообразию генетического материала у виру­сов. Эта гипотеза, которую иронически назвали гипотезой «взбесившихся генов», находит наибольшее число сторон-' ников, однако не в том первоначальном виде, в каком она была высказана, так как и она не объясняет наличие у вирусов форм генетического материала (однонитчатая ДНК, двунитчатая РНК), отсутствующих в клетках,обра­зование   капсида,   существование  двух  форм  симметрии и т. п.

Вероятно, вирусы действительно являются дериватами генетических элементов клеток, но они возникали и эволю­ционировали вместе с возникновением и эволюцией клеточ­ных форм жизни. Природа как бы испробовала на вирусах все возможные формы генетического материала (разные виды РНК и ДНК), прежде чем окончательно остановила свой выбор на канонической его форме — двунитчатой ДНК, общей для всех клеточных форм организмов, начиная от бактерии и кончая человеком. Будучи, с одной стороны, автономными генетическими структурами, с дру­гой стороны, неспособными развиваться вне клеток, виру­сы на протяжении миллиардов лет биологической эволю­ции проделали настолько разнообразные пути развития, что^ отдельные их группы не имеют преемственной связи между собой. По-видимому, разные группы вирусов воз­никали в исторически разные времена из разных генетических элементов клеток и поэтому существующие в на­стоящее время разные группы вирусов имеют полифиле-тическое происхождение, т. е. не имеют единого общего предка. Тем не менее, 'универсальность генетического кода распространяется и на вирусы, свидетельствуя тем самым, что и они являются порождением органического мира земли.

Исторически сложилось представление о двух альтер­нативных механизмах проникновения в клетку вирусов животных — путем виропексиса (эндоцитоза) и путем слияния вирусной и клеточной мембран. Однако оба эти механизма не исключают, а дополняют друг друга.

Термин «виропексис», предложенный в . Фазе-касом де сан Гро, означает, что вирусная частица попадает в цитоплазму в результате инвагинации участка плазма-

тической мембраны и образования вакуоли, которая содержит вирусную частицу.

Рецепторный эндоцитоз. Виропексис представляет собой частный случай рецепторного или адсорбционного эндоцитоза. Этот процесс является обычным механизмом, благодаря которому в клетку поступают питательные и регуляторные белки, гормоны, липопротеины и другие вещества из внеклеточной жидкости. Рецепторный эндо­цитоз происходит в специализированных участках плаз­матической мембраны, где имеются специальные ямки, покрытые со стороны цитоплазмы особым белком с боль­шой молекулярной массой — клатрином. На дне ямки располагаются специфические рецепторы. Ямки обеспе­чивают быструю инвагинацию и образование покрытых клатрином внутриклеточных вакуолей. Полупериод про­никновения вещества внутрь клетки по этому механизму не превышает 10 мин с момента адсорбции. Количество образующихся в одну минуту вакуолей достигает более 2000. Таким образом, рецепторный эндоцитоз представляет собой хорошо слаженный механизм, который обеспечивает быстрое проникновение в клетку чужеродных ве­ществ.

Покрытые вакуоли сливаются с другими, более круп­ными цитоплазматическими вакуолями, образуя рецепто-сомы, содержащие рецепторы, но не содержащие клатрин, а те в свою очередь сливаются с лизосомами. Таким путем проникшие в клетку белки обычно транспортируют­ся в лизосомы, где происходит их распад на аминокисло­ты; они могут и миновать лизосомы, и накапливаться в других участках клетки в недеградированной форме. Альтернативой рецепторного эндоцитоза является жид­костный эндоцитоз, когда инвагинация происходит не в специализированных участках мембраны.

Большинство оболочечных и безоболочечных вирусов животных проникает в клетку по механизму рецепторного эндоцитоза. Эндоцитоз обеспечивает внутриклеточный транспорт вирусной частицы в составе эндоцитарной вакуоли, поскольку вакуоль может двигаться в любом направлении и сливаться с клеточными мембранами (включая ядерную мембрану), освобождая вирусную частицу в соответствующих внутриклеточных участках. Таким путем, например, ядерные вирусы попадают в ядро, а реовирусы — в лизосомы. Однако проникшие в клетку вирусные частицы находятся в составе вакуоли и отделены от цитоплазмы ее стенками.

Со времени открытия вирусов по настоящее время представления о природе вирусов претерпели значительные изменения.

Д. И. Ивановский и другие исследователи того времени подчеркивали два свойства вирусов, позволившие выделить их из общей массы микроорганизмов: фильтруемость и неспособность размножаться на всех искусственных пи­тательных средах. Позже выяснилось, что эти свойства не абсолютны,   так  как   были  обнаружены   фильтрующиеся

(Ь) формы бактерий и микоплазмы, растущие на искус­ственных питательных средах, по размерам приближаю­щиеся к наиболее крупным вирусам (вирусы оспы чело­века и животных).

Внутриклеточный паразитизм вирусов также оказался не абсолютным критерием, отграничивающим их от ос­тальных микроорганизмов. Внутриклеточными паразитами являются не только вирусы, но и некоторые бактерии (го­нококки, менингококки) и простейшие (малярийный плазмодий). С развитием знаний о вирусах были найдены более надежные критерии, например существование у вирусов только одной из двух нуклеиновых кислот, в то время как у всех других микроорганизмов имеются обе нуклеиновые кислоты — дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и рибонуклеиновая (РНК).

Другим уникальным свойством вирусов является отсут-^" ствие у них собственных белок-синтезирующих систем. Синтез вирусных белков осуществляется белок-синтези-рующим аппаратом клетки — клеточными рибосомами, ко­торые связываются с вирусными иРНК. Вирусы вводят в клетку лишь свою генетическую информацию, которая успешно конкурирует с клеточной информацией, несмотря на ничтожно малые размеры вирусных геномов (на 5—6 порядков меньших по молекулярным массам, чем геном эукариотической клетки). Поэтому и уровень паразитизма у вирусов иной, чем у бактерий Или простейших: в отличие от внутриклеточного паразитизма последних паразитизм вирусов определяется как генетический паразитизм, а ви­русы рассматриваются как генетические паразиты. Ярким примером генетического паразитизма является способность ряда вирусов интегрировать (объединяться) с клеточным геномом. В этом случае вирусные гены превращаются в группу клеточных генов и обозначаются как провирус. Стадия интеграции, помимо умеренных ДНК-содержащих фагов, характерна для онкогенных ДНК-содержащих вирусов и вируса гепатита В. Эта стадия обязательна для большой группы РНК-содержащих вирусов — ретро-вирусов.

Однако и в том случае, когда интеграции не происхо­дит и вирусный геном находится в автономном состоя­нии, возникновение инфекции обусловлено конкуренцией вирусного и клеточного геномов.

К уникальным свойствам вируса относится его способ размножения, который резко отличается от способов раз­множения  всех  других  клеток и  организмов   (бинарное

деление, почкование, образование спор). Вирусы не растут, и их размножение обозначается как дисъюнктивная (разобщенная) репродукция, что подчеркивает разобщен­ность в пространстве (на территории клетки) и времени синтеза вирусных компонентов (нуклеиновых кислот и белков) с последующей сборкой и формированием вирио-нов.

В связи с вышеизложенным не раз возникали дискус­сии по поводу того, что же такое вирусы — живое или не живое, организмы или не организмы. Безусловно, вирусы обладают основными свойствами всех других форм жиз­ни — способностью размножаться, наследственностью, изменчивостью, приспособляемостью к условиям внешней среды; они занимают определенную экологическую нишу, на них распространяются законы эволюции органического мира на земле. Поэтому к середине 40-х годов сложи­лось представление о вирусах как о наиболее простых микроорганизмах. Логическим развитием этих взглядов было введение термина «вирион», обозначавшего внекле­точный вирусный индивидуум. Однако с развитием иссле­дований по молекулярной биологии вирусов стали накап­ливаться факты, противоречащие представлению о виру­сах как организмах.

Отсутствие собственных белок-синтезирующих систем, дисъюнктивный способ репродукции, интеграция с клеточ­ным геномом, существование вирусов сателлитов и дефект­ных вирусов, феноменов множественной реактивации и комплементации — все это мало укладывается в представ­ление о вирусах как организмах. Представление это еще более теряет смысл, когда мы обратимся к вирусоподоб­ным структурам — плазмидам, вироидам и агентам типа возбудителя скрепи.

Плазмиды (другие названия — эписомы, эпивирусы) представляют двунитчатые кольцевые ДНК с молекуляр­ной массой в несколько миллионов, реплицируемые клет­кой. Они вначале были обнаружены у прокариотов, и с их существованием связаны разные свойства бактерий, например устойчивость к антибиотикам. Поскольку плаз­миды обычно не связаны с бактериальной хромосомой (хотя многие из них способны к интеграции), их считают экстрахромосомными факторами наследственности.

Плазмиды были обнаружены и у эукариотов (дрожжей

. и других грибов),  более того,  обычные вирусы  высших

животных также могут существовать в виде плазмид, т. е.

кольцевых ДНК, лишенных собственных белков и репли-

цируемых клеточными ферментами синтеза ДНК. В част­ности, в виде плазмид могут существовать вирусы папил­ломы коров, обезьяний вирус 40 (8У40). При персистенции вируса герпеса в культуре клеток могут образовываться плазмиды — кольцевые ДНК, составляющие лишь часть генома этого вируса.

К вирусам примыкают вироиды — агенты, открытые Т. О. Дайнером в ., вызывающие заболевания неко­торых растений и способные передаваться как обычные инфекционные вирусы. При их изучении оказалось, что это сравнительно небольшие по размерам молекулы коль­цевой суперспирализованной РНК, состоящие из немно­гих, 300—400 нуклеотидов. Механизм репликации вирои-дов не вполне ясен.

Наконец, следует упомянуть об агенте скрепи — воз­будителе подострой трансмиссивной губкообразной энце­фалопатии овец. Вероятно, сходные агенты вызывают и другие формы губкообразных энцефалопатии животных и человека, в основе которых лежит прогрессирующее разрушение нервных клеток, в результате чего мозг при­обретает губчатую (спонгиоформную) структуру. Агент скрепи имеет белковую природу и даже получил специ­альное название — прион (от слов рго1ешасеош шгесйош; рагйс1е — белковая инфекционная частица). Предполага­ется, что этот белок является одновременно и индуктором и продуктом какого-то клеточного гена, ставшего авто­номным и ускользнувшего от регуляции («взбесившийся ген»).

Все вирусы, включая сателлиты и дефектные вирусы, плазмиды, вироиды и даже агенты скрепи (их гены), име­ют нечто общее, их объединяющее. Все они являются автономными генетическими структурами, способными функционировать и репродуцироваться в восприимчивых к ним клетках животных, растений, простейших, грибов, бактерий. По-видимому, это наиболее общее определение, позволяющее очертить царство вирусов. На основании сформулированного определения вирусы, не будучи орга­низмами, тем не менее являются своеобразной формой жизни и поэтому подчиняются законам эволюции орга­нического мира на земле.

В зараженной клетке вирусный геном кодирует синтез двух групп белков: 1) структурных, которые входят в со­став вирусных частиц потомства, и 2) неструктурных, которые обслуживают процесс внутриклеточной репродук­ции вируса на разных его этапах, но в состав вирусных частиц не входят.

Структурные белки. Количество структурных белков в составе вирусной частицы варьирует в широких пределах в зависимости от сложности организации вириона. Наибо­лее просто организованный вирус табачной мозаики со­держит всего один небольшой белок с молекулярной массой 17—18- 10³, некоторые фаги содержат 2—3 белка, просто организованные вирусы животных — 3—4 белка. Сложно устроенные вирусы, такие как вирусы оспы, содержат более 30 структурных белков.

Структурные белки делятся на 2 группы:

1)         капсидные белки, образующие капсид, т. е. футляр для нуклеиновой кислоты вируса (от лат. сарза — вме­стилище), и входящие в состав капсида геномные белки, и ферменты;

2)    суперкапсидные белки, входящие в состав суперкап-сида, т. е. наружной вирусной оболочки.

Поскольку суперкапсид называют также «пеплос» (от греч. рер1оз — покров, мантия), эти белки называют пепло-мерами.

Просто организованные вирусы, представляющие собой нуклеокапсид, содержат только капсидные белки. Сложно организованные вирусы содержат капсидные и суперкап-слдные белки.

Капсидные белки. Первоначальное представление о том, что капсидные белки являются всего лишь инерт­ной оболочкой для вирусной нуклеиновой кислоты, сложи­лось на основании изучения наиболее просто организо­ванного вируса табачной мозаики, частица которого со­стоит из одной молекулы РНК и одного типа белка, образующего чехол для РНК. Однако такое представление неправильно. Хотя основной функцией капсидных белков

является функция защиты вирусного генома от неблаго­приятных воздействий внешней среды, у многих вирусов в составе капсида есть белки и с другими функциями. Поэтому термин «капсид» далеко выходит за пределы представления о нем как о футляре или чехле для вирус­ной нуклеиновой кислоты.

В составе капсида некоторых вирусов (пикорнавирусы, паповавирусы, аденовирусы) содержатся белки, ковалент-но связанные с вирусным геномом (геномные белки). Эти белки являются терминальными, т. е. соединенными с концом вирусной нуклеиновой кислоты. Функции их неразрывно связаны с функциями генома и их регуля­цией.

У ряда сложно организованных вирусов в составе кап­сида имеются ферменты, осуществляющие транскрипцию и репликацию вирусного генома — РНК и ДНК (РНК-и ДНК-полимеразы), а также ферменты, модифицирую­щие концы иРНК. Если ферменты и геномные белки представлены единичными молекулами, то капсидные бел­ки представлены множественными молекулами. Эти белки и формируют капсидную оболочку, в которую у сложно организованных вирусов вставлены молекулы белков с дру­гими функциями.

Основным принципом строения капсидной оболочки вирусов является принцип субьединичности, т. е. построе­ние капсидной оболочки из субъединиц-капсомеров, обра­зованных идентичными полипептидными цепями. Пра­вильно построенные белковые субъединицы — капсомеры возникают благодаря способности вирусных капсидных белков к самосборке. Самосборка объясняется тем, что упорядоченная структура — капсид имеет наименьшую свободную энергию по сравнению с неупорядоченными белковыми молекулами. Сборка капсидной оболочки из субъединиц запрограммирована в первичной структуре белка и происходит самопроизвольно или при взаимо­действии с нуклеиновой кислотой.

Принцип субъединичности в строении вирусного капси­да является универсальным свойством капсидных белков и имеет огромное значение для вирусов. Благодаря этому свойству достигается огромная экономия генетического материала. Если бы капсидная оболочка была построена из разных белков, то на кодирование ее потребовалась бы основная часть генетической информации, заложенной в вирусном геноме. В действительности на кодирование, например,   одной   полипептидной   цепи   вируса   табачной

мозаики, расходуется менее 10% генома. Далее, в меха­низме самосборки заложена возможность контроля за полноценностью вирусных полипептидов: дефектные и чу­жеродные полипептидные цепи при таком способе сборки вирионов будут автоматически отбрасываться.

Описанная способность к самосборке в пробирке и в зараженной клетке характерна только для простых виру­сов. Сборка сложно организованных вирусов является го­раздо более сложным многоступенчатым процессом, хотя отдельные ее этапы, например формирование капсидов и нуклеокапсидов, также основаны на самосборке.

Суперкапсидные белки. Гликопротеиды. Суперкапсидные белки, или пепломеры, располагаются в липопротеидной оболочке (суперкапсиде или пеплосе) сложно устроенных вирусов. Они либо пронизывают насквозь липидный бислой как, например, гликопротеиды альфа-вирусов (вируса леса Семлики), либо не доходят до внутренней поверхности. Эти белки являются типичны­ми внутримембранными белками и имеют много общего с клеточными мембранными белками. Как и последние, суперкапсидные белки обычно гликозилированы. Углевод­ные цепочки прикреплены к молекуле полипептида в опре­деленных участках. Гликозилирование осуществляют кле­точные ферменты, поэтому один и тот же вирус, проду­цируемый разными видами клеток, может иметь разные у углеводные остатки: может варьировать как состав угле­водов, так и длина углеводной цепочки и место прикреп­ления ее к полипептидному остову.

У большинства вирусов гликопротеиды формируют «шипы» на поверхности вирусной частицы, длина которых достигает 7—10 им. Шипы представляют собой морфоло­гические субъединицы, построенные из нескольких моле­кул одного и того же белка. Вирусы гриппа имеют два типа шипов, построенных соответственно из гемагглютини-на и нейраминидазы. Парамиксовирусы также имеют два типа шипов, построенных соответственно из двух глико-протеидов (НИ и Р), рабдовирусы имеют только один гликопротеид и, соответственно, один тип шипов, а альфа-вирусы имеют два или три гликопротеида, формирующих один тип шипов.

Гликопротеиды являются амфипатическими молекула­ми: они состоят из наружной, гидрофильной части, кото­рая содержит на конце аминогруппу ДО -конец), и погру­женной в липидный бислой, гидрофобной части, которая содержит на погруженном конце гидроксильную группу

(С-конец). С-концом полипетид «заякоривается» в липид ном бислое. Есть, однако, и исключения из этого общего положения: нейраминидаза вируса гриппа взаимодействует с липидным бислоем не С-, а г4-концом.

Основной функцией гликопротеидов является взаимо­действие со специфическими рецепторами клеточной поверхности. Благодаря этим белкам осуществляется рас­познавание специфических клеточных рецепторов и прик­репление к ним вирусной частицы, т. е. адсорбция вируса на клетке. Поэтому гликопротеиды, выполняющие эту функцию, называют вирусными прикрепительными белка­ми.

Другой функцией гликопротеидов является участие в слиянии вирусной и клеточной мембран, т. е. в событии, ведущем к проникновению вирусных частиц в клетку. Ви­русные белки слияния ответственны за такие процессы, как гемолиз и слияние плазматических мембран соседних кле­ток, приводящие к образованию гигантских клеток, синци-тиев и симпластов.

«Адресная   функция»   вирусных   белков. Вирусы вызывают инфекционный процесс у относительно небольшого круга хозяев. Вирус должен «узнать» чувст­вительную клетку, которая сможет обеспечить продукцию полноценного вирусного потомства. Если бы вирус прони­кал в любую клетку, которая встретилась на его пути, это привело бы к исчезновению вирусов в результате деструк­ции "«родительской» вирусной частицы и отсутствия вирус­ного потомства. В процессе эволюции у вирусов выраба­тывалась так называемая адресная функция, т. е. поиск чувствительного хозяина среди бесконечного числа нечув­ствительных клеток. Эта функция реализуется путем на­личия специальных белков на поверхности вирусной ча­стицы,  которые узнают специфический рецептор на по­верхности чувствительной клетки.

Неструктурные белки. Неструктурные белки изучены гораздо хуже, чем структурные, поскольку их выделяют не из очищенных препаратов вирусов, а из зараженных клеток, и возникают трудности в их идентификации и очи­стке от клеточных белков.

К неструктурным белкам относятся:

1)           предшественники вирусных белков, которые отлича­ются от других неструктурных белков нестабильностью в зараженной клетке в результате быстрого нарезания на структурные белки;

2)     ферменты синтеза РНК и ДНК (РНК- и ДНК-26

полимеразы), обеспечивающие транскрипцию и реплика­цию вирусного генома;

3)           белки-регуляторы;

4)     ферменты,  модифицирующие вирусные  белки,  на­пример протеиназы и протеинкиназы.

Однако многие неструктурные белки при ряде вирус­ных   инфекций   еще   не   идентифицированы   и   функции их не  определены.  Типы  структурных  и  неструктурных белков просто и сложно устроенных вирусов и их функ-' ции показаны на схеме

Биофизические свойства вирусов характеризуются многими показателями — седиментацией, плотностью, вязкостью вирусных суспензий, диффузионными свойст-

 

Седиментационные свойства вирусов и субвирусных компонентов измеряют с помощью центрифугирования в аналитических и препаративных ультрацентрифугах. Коэффициент седиментации выражают в единицах Свед-^РГЗ ,?₀^{ереводе на стан}Дартные условия — при темпе­ратуре 20 С в воде и обозначают как 8₂<ш.

Коэффициенты седиментации вирионов зависят от многих факторов: от их размера и массы, плотности, формы. Для определения плотности вирионов и субви­русных структур применяют равновесное центрифугиро­вание в градиентах плотности. Для вирионов и вирусных нуклеопротеидов обычно используют градиенты плотности сахарозы и хлорида цезия.

Плотность вирионов и субвирусных структур зависит прежде всего от их состава. Она увеличивается с увели­чением процента содержания нуклеиновых кислот и уменьшается при повышении содержания белков и липи-дов (табл. 6)

 

 

 

 

вами. Все эти характеристики относятся также к суб­вирусным компонентам. Наиболее важными биофизи­ческими характеристиками вирусов являются седимента-ционные и плотностные свойства. Они чаще всего изме­ряются при исследовании вирусов.